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Syphilis-IgM

Luminosystems

VERWENDUNGSZWECK
Bei dem Syphilis-IgM-ELISA handelt es sich um einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) zum Nachweis von IgM-Klasse-Antikörpern gegen Treponema pallidum in humanem Serum oder Plasma. Dieser Assay ist ausschließlich für den In vitro-Gebrauch bestimmt.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
Bei Treponema pallidum handelt es sich um den Erreger der Syphilis, einer infektiösen, systemischen Krankheit, die durch periodisch auftretende aktive, gerötete Manifestationen sowie durch eine jahrelange Latenzzeit ohne Auftreten von Symptomen gekennzeichnet ist. Syphilis wird traditionell klassifiziert als eine erworbene oder eine angeborene Erkrankung. Jede weitere Klassifikation erfolgt auf Basis des natürlichen Krankheitsverlaufs. Bei der erworbenen Syphilis wird die Infektion im Normalfall durch Geschlechtsverkehr übertragen. Die Inkubationszeit von Syphilis kann von 1 bis zu 13 Wochen variieren, beträgt jedoch gewöhnlich 3-4 Wochen. Nicht behandelte Patienten mit primärer oder sekundärer Syphilis, die aktive Läsionen aufweisen, sind hochinfektiös. Das Infektionsrisiko ist am höchsten innerhalb der ersten 2 Jahre nach Ansteckung. Betroffen sind fast alle Organe und Gewebe des Körpers, einschließlich der meisten Körperflüssigkeiten. Mehr als 80% der Patienten weisen Läsionen der Schleimhaut auf, bei 50% liegt eine allgemeine Vergrößerung der Lymphknoten vor und ungefähr 10% weisen Läsionen der Augen, der Knochen und Gelenke, der Meningen, der Leber und Milz auf. Milde körperliche Symptome wie Unwohlsein, Kopfschmerz, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Knochenschmerzen und Müdigkeit liegen häufig vor. Die angeborene Syphilis wird durch die Übertragung von T. pallidum über die Plazenta verursacht. Klinische Manifestationen können bei der Geburt vorliegen, werden jedoch häufiger in einem Alter von 3 Wochen bis zu 6 Monaten beobachtet. Bei einer Infektion mit T. pallidum werden zwei Antikörper-Typen produziert: nicht-treponemale Antikörper (Reagin) und treponemale Antikörper. Bei der Diagnose der Syphilis wird der ELISA zum Nachweis von IgG- und IgM-Antikörpern zum Goldstandard.


TESTPRINZIP
Das E-SPM-K17 Syphilis-IgM-Kit basiert auf der ELISA-Methode. Bei Durchführung des Assays werden die Kontrollen und die Proben in Mikrotitrationswells inkubiert, die mit aufgereinigtem und inaktiviertemTreponema-Antigen beschichtet sind. Nach Inkubation und Waschen werden die Wells mit einem Konjugat behandelt, bestehend aus anti-humanen, Peroxidase-markierten IgM-Antikörpern. Nach einem zweiten Inkubations- und Waschschritt werden die Näpfe mit dem Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) inkubiert. Nach Zugabe einer sauren Stopp-Lösung wird das Ausmaß des enzymatischen Umsatzes des Substrats durch eine Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die gemessene Absorption ist direkt proportional zur vorliegenden Konzentration von anti-Treponema IgM-Antikörpern.

REAGENZIEN

Die Menge an Reagenz im vorliegenden Syphilis-IgM-ELISA-Kit ist ausreichend für 96 Wells. In jedem Kit sind die nachfolgend angegebenen Reagenzien enthalten:

ENTHALTENES MATERIALMENGEKATALOG-NR.
Treponema- Antigen-beschichteter Mikrotitrationsstreifen
Waschkonzentrat
Proben-Verdünnungslösung
TMB-Substrat
Negativ-Kontrolle
Cut-Off-Kontrolle
Positiv-Kontrolle
Zweitantikörper-Konjugat
Stopp-Lösung
Sorbent M

Eine Platte
Eine Flasche
Eine Flasche
Eine Flasche
Ein Vial
Ein Vial
Ein Vial
Eine Flasche
Eine Flasche
Eine Flasche

E-SPM-10
E-WSL-30
E-DLB-40
E-TMB-08
E-SPM-01
E-SPM-02
E-SPM-03
E-SPM-20
E-STP-09
E-SOR-21

NICHT ENTHALTENES MATERIAL

  • Mikrotitrationsplatten-Lesegerät für Absorptionsmessung bei 450 nm
  • Deionisiertes/Destilliertes Wasser
  • Präzisionspipette zum Pipettieren von 10 ml, 100 ml und 1 ml
  • Halbautomatische Pipette zum Pipettieren von 100 ml
  • Automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten
  • Saugfähige Unterlage zum Trocknen der Streifen

Treponema-Antigen-beschichtete Mikrotitrationsstreifen:
Ein Streifenhalter mit 12×8 (96) Mikrotitrationswells, beschichtet mit Treponema pallidum-Antigen. Lagern Sie die Mikrotitrationsstreifen bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C. Entnehmen Sie den Einsatz und die benötigten Streifen aus der Folienumverpackung und geben Sie die nicht verwendeten Streifen zusammen mit dem Silica-Gel in die Tasche aus Polyäthylen. Pressen Sie die Luft aus der Tasche und versiegeln Sie diese, indem Sie den Verschluss fest andrücken. Nach Anbruch ist das Produkt bei 2-8°C 4 Wochen stabil.

Waschkonzentrat:
Eine Flasche mit 100 ml einer 10-fach konzentrierten, phosphatgepufferten Salinelösung mit 0.5% Brij (Gewichtsprozent, w/v). Verdünnen Sie das Waschkonzentrat vor dem Gebrauch mit deionisiertem/destilliertem Wasser. Lagern Sie das Waschkonzentrat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Proben-Verdünnungslösung: 
Eine Flasche mit 100 ml einer Proteinlösung mit 0.09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Lagern Sie die Proben-Verdünnungslösung bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Treponema  IgM-Kontrollen:
Drei Vials, negativ, Cut-Off und positiv, mit jeweils 2 ml humanem Serum in einem 0.01 M Phosphatpuffer mit 0.09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Lagern Sie die Kontrollen bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Zweitantikörper-Konjugat:
Eine Flasche mit 12 ml Peroxidase-markierter, anti-humaner, monoklonaler IgM-Antikörper in einer Phosphatpuffer-Lösung mit 0.02% Proclin. Lagern Sie das Zweitantikörper-Konjugat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Sorbent M : 
Eine Flasche mit 7 ml einer Proteinlösung in einer Phosphatpuffer-Lösung mit 0.02% Proclin. Lagern Sie das Sorbent M bei 2°-8° C.

TMB-Substrat:
Eine Flasche mit 12 ml von in Citratpuffer, pH 3.8, stabilisiertem Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid. Lagern Sie das TMB-Substrat bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

Stopp-Lösung:
Eine Flasche mit 15 ml einer 0.3 M H2SO4-Lösung. Lagern Sie die Stopp-Lösung bis zum Erreichen des Verfallsdatums bei 2-8°C.

VORSICHTSMASSNAHMEN
Für den In vitro-Gebrauch
Es sollten die nachfolgend aufgeführten, allgemeinen GLP (Gute Laborpraxis, Good Laboratory Practice)-Regeln beachtet werden:
Während des Umgangs mit immundiagnostischem Material sind Essen, Trinken, Rauchen sowie die Verwendung von Kosmetika untersagt. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Tragen Sie während des Umgangs mit immundiagnostischem Material einen Labormantel und Einweghandschuhe. Waschen Sie sich nach Beenden der Arbeit gründlich die Hände. Decken Sie die Arbeitsfläche mit saugfähigem Papier für den Einweg-Gebrauch ab. Entfernen Sie verschüttetes Material umgehend und dekontaminieren Sie die betroffenen Oberflächen. Vermeiden Sie Aerosolbildung. Sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung. Befolgen Sie bei Handhabung und Entsorgung aller Reagenzien und Materialien die entsprechenden gesetzlichen Vorgaben.
WARNUNG: POTENTIELLER BIOLOGISCHER RISIKOSTOFF
Dieses Kit kann einige Reagenzien enthalten, die unter Verwendung von Material humanen Ursprungs (z. B. Serum oder Plasma) hergestellt oder zusammen mit diesem verwendet werden. Das in diesem Kit enthaltene Material wurde unter Verwendung CE-empfohlener Methoden nicht-reaktiv auf HIV-1/2-Antikörper, HCV und HBsAg getestet. Keine aktuelle Testmethode bietet eine vollständige Sicherheit hinsichtlich der biologischen Unbedenklichkeit. Handhaben Sie alle Reagenzien und Patientenproben entsprechend der Biologischen Sicherheitsstufe 2, wie in dem Handbuch der Centers for Disease Control/National Institutes of Health, „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,“ 4thEdition, April 1999, für alle potentiell infektiösen humanen Materialien empfohlen.
WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN:
Einige der Reagenzien in diesem Kit enthalten als Konservierungsmittel Natriumazid in Konzentrationen unterhalb des behördlichen Grenzwerts von <0.1%. Trotz starker Verdünnung wirkt konzentriertes Natriumazid reizend auf Haut und Schleimhäute. Bei Reaktion von Natriumazid mit Rohrleitungen aus Blei und Kupfer kann es insbesondere bei Akkumulation zur Entstehung explosiver Metallazide kommen. TMB und Schwefelsäure wirken in größeren Mengen ebenfalls reizend auf Haut und Schleimhäute. Diese Substanzen liegen in verdünnter Form vor; dennoch besteht weiterhin ein geringes Risiko. Sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung. Vermeiden Sie einen Kontakt mit der Haut, den Augen und der Kleidung. Spülen Sie bei einem Kontakt mit einem der genannten Reagenzien die betroffene Stelle gründlich mit Wasser und suchen Sie einen Arzt auf. Führen Sie alle ungefährlichen Reagenzien erst nach Verdünnen mit einer großen Menge Wasser dem Abwasser zu, um einer Akkumulation chemischer Risikostoffe im Rohrleitungssystem vorzubeugen.
Für weitere Informationen hinsichtlich der in dem Kit enthaltenen Gefahrstoffe siehe die auf Anfrage erhältlichen, komponentenspezifischen MSDS.


PROBENAHME UND -HANDHABUNG
Es sollte Serum verwendet werden. Bei der Probenahme sollten die allgemeinen Vorsichtmaßnahmen zur Venenpunktion beachtet werden. Die Proben können bei 2-8°C 2 Tage gelagert werden. Lagern Sie die Proben über einen längeren Zeitraum bei -20°C. Verwenden Sie keine hämolytischen oder lipämischen Proben. Vermeiden Sie ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben.

ASSAY-VORBEREITUNG
Das vollständige Verständnis der vorliegenden Packungsbeilage ist Voraussetzung für eine erfolgreiche Verwendung des Produkts. Zuverlässige Ergebnisse werden ausschließlich bei Anwendung präziser Labormethoden sowie sorgfältiger Befolgung der in Packungsbeilage enthaltenen Angaben erhalten. Erwärmen Sie alle Proben und die im Kit enthaltenen Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (~25°C). Mischen Sie die Reagenzien und Proben durch vorsichtiges Invertieren vor der Verwendung gründlich. Vermeiden Sie die gemeinsame Verwendung verschiedener Chargen der einzelnen Kit-Komponenten innerhalb eines Assays. Verwenden Sie die einzelnen Komponenten nicht nach Ablauf des auf dem Aufkleber angegebenen Verfallsdatums. Unvollständiges Waschen hat einen nachteiligen Einfluss auf das Resultat und die Genauigkeit des Assays. Zur Verminderung potentieller Abweichungen infolge unterschiedlicher Substrat-Inkubationszeiten sollten die Stopp-Lösung und die TMB-Chromogen-Lösung in gleicher Reihenfolge und Geschwindigkeit in die Wells pipettiert werden. Vermeiden Sie eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien, insbesondere des Konjugats, des Waschpuffers und der Verdünnungslösung. Vermeiden Sie eine Verunreinigung der TMB-Chromogen-Lösung durch das Konjugat. Verwenden Sie eine saubere Einweg-Pipettenspitze für jedes Reagenz. Verwenden Sie keine Pipetten mit Komponenten aus Metall. Die für Konjugat und TMB verwendeten Gefäße und Spitzen halbautomatischer Pipetten können unter der Voraussetzung wiederverwendet werden, dass sie gründlich mit deionisiertem Wasser gespült sowie vor und nach jedem Gebrauch getrocknet werden. Das zur Markierung verwendete Enzym wird durch Sauerstoff inaktiviert und ist hochempfindlich gegenüber mikrobieller Kontamination, Natriumazid, hypochloriger Säure und aromatischen Chlorhydrocarbonen. Aromatische Chlorhydrocarbone werden häufig in der Wasserversorgung von Laboren nachgewiesen. Verwenden Sie qualitativ hochwertiges Wasser. Vermeiden Sie während der Lagerung und Inkubation der Reagenzien eine Exposition gegenüber großer Hitze oder starkem Sonnenlicht.

VORBREITUNG DER REAGENZIEN:

Waschlösung:
Verdünnen Sie das Waschkonzentrat vor dem Gebrauch 1:10 mit deionisiertem/destilliertem Wasser. Lösen Sie eventuell vorhandene Kristalle vor dem Verdünnen bei 37°C. Geben Sie 100 ml des Waschkonzentrats in ein sauberes Gefäß und verdünnen Sie es durch Zugabe von 900 ml deionisiertes/destilliertes Wasser. Mischen Sie die Lösung gründlich durch Invertieren des Behälters. Die Waschlösung ist bei Lagerung in einer fest verschlossenen Flasche bei Raumtemperatur 5 Tage und bei 2-8°C 2 Wochen stabil.

Mikrotitrationsstreifen:
Wählen Sie die für den Assay erforderliche Anzahl von beschichteten Streifen. Die restlichen, nicht verwendeten Wells sollten zusammen mit einem Trockenmittelbeutel in der wiederverschließbaren Hülle aufbewahrt werden. Zum Schutz vor Feuchtigkeit  muss die Hülle erneut versiegelt werden.

Assay-Durchführung:
Alle Proben und Reagenzien müssen vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (~25°C) erwärmt werden. Serum-Proben und Kontrollen sollten in zweifacher Ausfertigung analysiert werden.

  1. Kennzeichnen Sie die verwendeten Mikrotitrationsstreifen.
  2. Verdünnen Sie die Serum-Proben im Verhältnis 1:101. Pipettieren Sie hierzu 10 ml Serum in 1 ml Assay-Puffer.
  3. Pipettieren Sie jeweils 100 ml der verdünnten Serum-Proben sowie der gebrauchsfertigen Kontrollen in die entsprechenden Wells. Lassen Sie ein Well für den Leerwert frei. In dieses Well wird während des Substrat-Inkubationsschritts 100 ml des TMB-Substrats pipettiert. Geben Sie 30 ml Sorbent M ausschließlich in die Wells, die die verdünnten Proben enthalten.
  4. Inkubieren Sie 45 Minuten bei 37°C.
    Saugen Sie die Flüssigkeit in den Wells ab und waschen Sie jedes Well vier (4) Mal 30 Sekunden lang mit Waschlösung. Waschen Sie die Mikrotitrationsplatten mit Hilfe eines Dispensers manuell oder verwenden Sie eine automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten. Drehen Sie die Platte um und legen Sie sie auf eine saugfähige Unterlage. Trocknen Sie die Platte durch vorsichtiges Ausklopfen.
    HINWEIS: Die Verwendung einer automatischen Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten wird nachdrücklich empfohlen. Unvollständiges Waschen hat einen nachteiligen Effekt auf die Assay-Genauigkeit. Ist keine automatische Waschvorrichtung verfügbar, dann (a) saugen Sie die Flüssigkeit vollständig aus jedem Well ab, (b) dispensieren Sie 300 µl Waschlösung in jedes Well und (c) wiederholen Sie Schritte (a) und (b) vier Mal.
  5. Fügen Sie 100 ml des enzmymarkierten Zweitantikörper-Konjugats zu jedem Well hinzu.
  6. Inkubieren Sie 45 Minuten bei 37°C.
    Saugen Sie die Flüssigkeit ab und waschen Sie jedes Well vier Mal 30 Sekunden lang mit Waschlösung. Waschen Sie die Mikrotitrationsplatten mit Hilfe eines Dispensers manuell oder verwenden Sie eine automatische Waschvorrichtung für Mikrotitrationsplatten. Drehen Sie die Platte um und legen Sie sie auf eine saugfähige Unterlage. Trocknen Sie die Platte durch vorsichtiges Ausklopfen.
  7. Fügen Sie mit Hilfe eines Dispensers100 ml TMB-Chromogen-Lösung zu jedem Well hinzu.
  8. Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie eine Exposition gegenüber direktem Sonnenlicht.
  9. Fügen Sie mit Hilfe eines Dispensers 100 ml Stopp-Lösung zu jedem Well hinzu.
  10. Messen Sie die Absorption der Lösung in den Wells innerhalb von 30 Minuten. Verwenden Sie ein auf 450 nm eingestelltes Lesegerät für Mikrotitrationsplatten. Ist eine Wellenlängekorrektur verfügbar, stellen Sie das Gerät auf duale Wellenlängenmessung bei 450 nm mit Hintergrund-Wellenlängenkorrektur bei 600 oder 620 nm ein.

ERGEBNISSE
Berechnen Sie die mittlere Absorption für jede Kontrolle und jede Probe.

Qualitative Ergebnisse:

  • Ist die Absorption der Probe höher als die des Cut-Off, ist die Probe positiv für das spezifische IgM.
    Berechnen Sie den Quotienten aus dem Mittelwert der OD der Probe und dem entsprechenden Cut-Off-Wert. Die Probe gilt als:
    Positiv: bei einem Quotienten von > 1.1.
    Nicht eindeutig: bei +/- 10% des Cut-Off.
    Negativ: bei einem Quotienten von < 0.9.

Wiederholen Sie den Test, falls das Ergebnis nicht eindeutig ist. Ist das Ergebnis weiterhin nicht eindeutig, dann wiederholen Sie die Serum-Probenahme.

EINSCHRÄNKUNGEN DER TESTDURCHFÜHRUNG

  • Eine während der späten Phase der Infektion entnommene Serum-Probe wird mit diesem Assay möglicherweise negativ getestet, da in dieser Phase ausschließlich IgG-Antikörper vorhanden sind.
  • Das Testergebnis sollte zusammen mit aus der Auswertung anderer klinischer und diagnostischer Verfahren verfügbaren Informationen verwendet werden.
  • Vermeiden Sie ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Reagenzien und Proben.
  • Vermeiden Sie die Verwendung stark hämolytischer, ikterischer oder lipämischer Proben.
  • Vermeiden Sie die Verwendung hitzeinaktivierter Seren.

QUALITÄTSKONTROLLE

Subtrahieren Sie den Leerwert von allen anderen Messwerten. Die OD-Werte der Cut-Off-Kontrolle müssen mindestens 0.2 betragen. Die OD der Positiv-Kontrolle muss mindestens das 1.5-fache des Werts der Cut-Off-Kontrolle betragen.

PERFORMANZ-MERKMALE

1. Sensitivität und Spezifität
80 humane Seren wurden mit dem vorliegenden Syphilis-IgM-ELISA sowie einem kommerziell erhältlichen Referenz-ELISA (Test A) untersucht. Von 80 Proben wurden mit dem E-SPM-K17-ELISA 3 Proben positiv auf IgM-Antikörper gegen Treponema pallidum getestet. Unter Verwendung des kommerziell erhältlichen ELISA wurden ebenfalls 3 Proben positiv getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammenfassend dargestellt.

PositivNegativFN (falsch negativ)FP (falsch positiv)
E-SPM-K1737700
Test A37700

2. Genauigkeit

2. Inter-Assay Studie
Anz. von 
Wiederh. 16
Serum 1Serum 2Serum 3
Mittelwert0.731.810.023
SD0.0530.0500.002
CV%7.222.79,7
2. Intra-Assay Studie
Anz. von 
Wiederh. 16
Serum 1Serum 2Serum 3
Mittelwert0,6070,9630.022
SD0.0120.0370.002
CV%1.99 3.889.4

LITERATUR

  1. S.A. Lukehart: Identification and characterization of Treponema pallidum antigens by monoclonal antibodies. in: Monoclonal  Antibodies, Academic Press 1986, p. 1.
  2. L. Lewis et al.: Evaluation of immunoglobulin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Microbiol. 28: 296 (1990).
  3. M. Norgard et al.: Sensitivity and specificity of monoclonal antibodies directed against antigenic determinants of Treponema pallidum Nichols in the diagnosis of syphilis. J. Clin. Microbiol. 20: 711 (1984).
  4. M.J. Bailey et al.: Production of murine monoclonal antibodies to the major axial filament polypeptide of Treponema pallidum. J. Gen. Microbiol. 133: 1805 (1987).